Cum se face analize spectrofotometrice: 13 pași (cu imagini)

Spectrofotometria este o tehnică experimentală care este utilizată pentru măsurarea concentrației de substanțe dizolvate într-o soluție specifică prin calcularea cantității de lumină absorbită de aceste substanțe dizolvate. Această tehnică este puternică deoarece anumiți compuși vor absorbi diferite lungimi de undă ale luminii la intensități diferite. Analizând lumina care trece prin soluția, puteți identifica anumite substanțe dizolvate în soluție și cât de concentrate sunt acele substanțe. Un spectrofotometru este dispozitivul utilizat pentru a analiza soluțiile într-un set de cercetare de laborator.

Pași

Partea 1 din 3:

Pregătirea probelor

1. Porniți spectrofotometrul. Cele mai multe spectrofotometre trebuie să se încălzească înainte de a putea da o citire exactă. Porniți aparatul și lăsați-l să stea cu cel puțin 15 minute înainte de a rula orice eșantioane.

Utilizați timpul de încălzire pentru a vă pregăti eșantioanele.

Imagine denumită Analiza spectrofotometrică Pasul 2

2. Curățați cuvele sau tuburile de testare. Dacă faceți un laborator pentru școală, este posibil să utilizați tuburi de testare de unică folosință care nu trebuie curățate. Dacă utilizați cuvete sau tuburi de testare reutilizabile, asigurați-vă că sunt curățate corespunzător înainte de utilizare. Clătiți fiecare cuvă cu apă deionizată.

Aveți grijă cu cuvele, deoarece acestea pot fi destul de scumpe, mai ales dacă sunt fabricate din sticlă sau cuarț. Cuvile cuarț sunt proiectate pentru a fi utilizate în spectrofotometria vizibilă UV.

La manipularea cuvei, evitați atingerea laturilor, lumina va trece (în general, laturile limpede ale recipientului). Dacă atingeți accidental aceste laturi, ștergeți cuva în jos cu o kimwipe (care sunt formulați pentru a preveni zgârierea geamului).

Imagine denumită Analiza spectrofotometrică Pasul 3

3. Încărcați volumul corespunzător al eșantionului în cuvă. Unele cuvete au un volum maxim de 1 mililitru (ml) în timp ce tuburile de testare pot avea un volum maxim de 5 ml. Atâta timp cât laserul care produce lumina trece prin lichid și nu o parte goală a recipientului, veți obține o citire exactă.

Dacă utilizați o pipetă pentru a încărca probele, utilizați un sfat nou pentru fiecare probă pentru a preveni contaminarea încrucișată.

Imagine denumită Analiza spectrofotometrică Pasul 4

4. Pregătiți o soluție de control. Cunoscut ca un martor, soluția de control are numai solventul chimic în care soluția care trebuie analizată este dizolvată în. De exemplu, dacă ați avut sare dizolvată în apă, martorul dvs. ar fi doar apă. Dacă vopiați roșii de apă, martorul trebuie să conțină și apă roșie. Blocul este același volum ca și soluția care trebuie analizată și păstrată în același tip de container.

Imagine denumită Analiza spectrofotometrică Pasul 5

5. Ștergeți exteriorul cuvei. Înainte de a plasa cuva în spectrofotometrul pe care doriți să-l asigurați că este la fel de curat posibil pentru a evita interferențele de la murdărie sau particule de praf. Folosind o cârpă liberă fără scame, îndepărtați picăturile de apă sau praful care poate fi în afara cuvei.

Partea 2 din 3:

Rularea experimentului

1. Alegeți și setați lungimea de undă a luminii pentru a analiza eșantionul cu. Utilizați o singură lungime de undă de lumină (culoarea monocromatică) pentru a face ca testarea să fie mai eficientă. Culoarea luminii aleasă ar trebui să fie una cunoscută a fi absorbită de una dintre substanțele chimice considerate a fi în soluționarea testului. Setați lungimea de undă dorită în funcție de specificațiile spectrofotometrului dvs.

Într-un laborator de clasă, lungimea de undă va fi probabil dată.
Deoarece eșantionul va reflecta toate luminile de aceeași culoare așa cum apare, lungimea de undă experimentală va fi întotdeauna o culoare diferită de cea a eșantionului.
Obiectele apar ca anumite culori deoarece reflectă lumina unor lungimi de undă particulare și absorbi toate celelalte culori. Iarba este verde deoarece clorofila din ea reflectă lumina verde și absoarbe orice altceva.

Imagine denumită Analiza spectrofotometrică Pasul 7

2. Calibrați mașina cu martorul. Așezați martorul în suportul cuvei și închideți capacul. Pe un spectrofotometru analogic, va fi un ecran cu un ac care se mișcă pe baza intensității detectării luminii. Când se află martorul, ar trebui să vedeți că acul se mișcă spre dreapta. Înregistrați această valoare în cazul în care aveți nevoie de mai târziu. Cu martorul încă în mașină, mutați acul la zero folosind butonul de reglare.

Spectrofotometrele digitale pot fi calibrate în același mod, vor avea doar o citire digitală. Setați martorul la 0 folosind butoanele de reglare.

Când scoateți martorul, calibrarea va fi în continuare în poziție. Când măsurați restul eșantioanelor, absorbția de la martor va fi în mod automat scăzută.

Asigurați-vă că utilizați un singur gol pe sesiune, astfel încât fiecare probă să fie calibrată la același martor. De exemplu, dacă vă aflați la spectrofotometru, apoi analizați numai câteva dintre eșantioane și necompletate, eșantioanele rămase ar fi inexacte. Ar trebui să începeți.

Imagine denumită Analiza spectrofotometrică Pasul 8

3. Scoateți martorul și testați calibrarea. Cu martorul eliminat, acul ar trebui să rămână la 0 (zero) sau citirea digitală ar trebui să continue să citească 0. Așezați martorul înapoi în mașină și asigurați-vă că acul sau citirea nu se schimbă. Dacă aparatul este calibrat corect cu martorul dvs., totul ar trebui să rămână la 0.

Dacă acul sau cititorul nu este 0, repetați pașii de calibrare cu martorul.

Dacă continuați să aveți probleme, să căutați asistență sau să aveți mașina să se uite la întreținere.

Imagine denumită Analiza spectrofotometrică Pasul 9

4. Măsurați absorbția probei experimentale. Scoateți martorul și plasați eșantionul experimental în mașină. Glisați cuva în canelura desemnată și asigurați-vă că se află în poziție verticală. Așteptați aproximativ 10 secunde până când acul este constant sau până când numerele digitale nu mai schimbă. Înregistrați valorile transmițătorului și / sau a absorbției%.

Absorbanța este, de asemenea, cunoscută sub numele de densitatea optică (OD).

Cu cât este mai multă lumină care este transmisă, cu atât mai puține lumină absoarbe proba. În general, doriți să înregistrați valorile de absorbție care de obicei vor fi date ca o zecimală, de exemplu, 0.43.

Dacă obțineți un rezultat periodic (cum ar fi 0.900 când restul sunt în jur de 0.400), diluați eșantionul și măsurați din nou absorbția.

Repetați citirea pentru fiecare probă individuală de cel puțin 3 ori și mediu împreună. Acest lucru asigură o citire mai precisă.

Imagine denumită Analiza spectrofotometrică Pasul 10

5. Repetați testul cu lungimi de undă succesive ale luminii. Eșantionul dvs. poate avea mai mulți compuși necunoscuți care vor varia în funcție de absorbția lor în funcție de lungimea de undă. Pentru a elimina incertitudinea, repetați citirile la intervale de 25 nm din spectru. Acest lucru vă va permite să detectați alte substanțe chimice suspectate că sunt în soluție.

Partea 3 din 3:

Analizând datele de absorbție

1. Calculați transmisia și absorbția eșantionului. Transmisia este cât de mult din lumina care a trecut prin eșantion a ajuns la spectrofotometru. Absorbanța este cât de mult a fost absorbită de una dintre substanțele chimice în soluție. Multe spectrofotometre moderne au o producție de transmisie și absorbție, dar dacă ați înregistrat intensitate, puteți calcula aceste valori.

Transmiterea (T) se găsește prin împărțirea intensității luminii care a trecut prin soluția de probă cu cantitatea care a trecut prin martor. În mod normal, este exprimată ca o zecimală sau procentaj. T = i / i₀ unde sunt intensitatea eșantionului și i₀ este intensitatea martorului.
Absorbanța (A) este exprimată ca fiind negativă a logaritmului de bază (exponent) a valorii de transmisie: a = -Log₁₀T. Pentru o valoare T de 0.1, valoarea A este 1 (0.1 este de 10 la puterea -1), ceea ce înseamnă că 10% din lumină este transmis și 90% este absorbit. Pentru o valoare T de 0.01, valoarea A este 2 (0.01 este de 10 la puterea -2), adică 1% din lumină este transmisă.

Imagine denumită Analiza spectrofotometrică Pasul 12

2. Complați valorile absorbției față de lungimile de undă pe un grafic. Valoarea absorbției este reprezentată grafic pe axa Y verticală împotriva lungimii de undă a luminii folosite pentru un anumit test reprezentat de axul X orizontal. Plotarea valorilor maxime de absorbție pentru fiecare lungime de undă de lumină testată, produce spectrul de absorbție al eșantionului și identifică compușii care formează substanța de testat și proporțiile acestora.

Un spectru de absorbție are, de obicei, vârfuri la anumite lungimi de undă care vă pot permite să identificați compuși specifici.

Imagine denumită Analiza spectrofotometrică Pasul 13

3. Comparați complotul spectrului de absorbție la parcelele cunoscute ale compușilor specifici. Compușii au un spectru unic de absorbție și vor produce întotdeauna un vârf la aceeași lungime de undă de fiecare dată când acestea sunt măsurate. Comparând parcelele de compuși necunoscuți la cei cunoscuți compuși, puteți identifica soluturile care vă compun soluția.

De asemenea, puteți utiliza această metodă pentru a identifica contaminanții din eșantionul dvs. Dacă vă așteptați la un vârf clar la o anumită lungime de undă și obțineți 2 vârfuri la lungimi de undă separate, știți că ceva nu este corect în eșantionul dvs.